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山羊白介素10(IL-10)elisa試劑盒說明書

發表時間:2024-01-26 16:26

                                                      山羊白介(jie)素10(IL-10)elisa試劑(ji)盒說明書

elisa試劑盒常見(jian)組成(cheng)部分:

1)酶和(he)底物:在ELISA中zui常用的(de)酶為HRP和(he)ALP。

2)抗體(ti)(ti):在ELISA中(zhong)應(ying)用(yong)的(de)抗體(ti)(ti)可分為(wei)多(duo)克隆(long)抗體(ti)(ti)(多(duo)抗)和(he)單(dan)克隆(long)抗體(ti)(ti)(單(dan)抗)。

3)抗原:在ELISA中應用的抗原要(yao)求有(you)較高(gao)的特(te)異(yi)性、親(qin)和(he)力和(he)純度。主(zhu)要(yao)有(you)三類,即自然抗原、人工(gong)合成抗原和(he)基(ji)因重組抗原。

4 人E選(xuan)擇素(E-Selectin/CD62E)檢測試劑盒包(bao)被:將免疫(yi)活性物質(zhi)(抗原或抗體)結合于固(gu)相載體上的過(guo)程稱(cheng)為(wei)包(bao)被。常(chang)用的材料(liao)有(you)聚苯乙(yi)烯、硝酸纖維薄膜等;常(chang)用的方法(fa)(fa)有(you)吸附法(fa)(fa)、化(hua)學交聯(lian)法(fa)(fa)及親和素-生物素間接包(bao)被法(fa)(fa)

5)固(gu)(gu)相載(zai)(zai)體:固(gu)(gu)相載(zai)(zai)體是ELISA中用(yong)以分離(li)結合標(biao)記物和(he)游離(li)標(biao)記物的(de)(de)(de)主要手段,應(ying)與各種免疫活(huo)性(xing)物質有良好(hao)的(de)(de)(de)結合性(xing)能并(bing)且不改(gai)變其(qi)免疫活(huo)性(xing)。常用(yong)的(de)(de)(de)固(gu)(gu)相載(zai)(zai)體有聚苯乙烯塑料和(he)硝酸纖維素膜。

樣本(ben)實驗前準備:

ELISA試劑盒液體(ti)樣本:包(bao)括血清、血漿、尿液、胸(xiong)腹(fu)水、腦脊液、細胞培養上清等。

(1)血清(qing)

室溫血液自然凝固(gu)10-20分鐘(zhong)后,離心(xin)20分鐘(zhong)左右(2000-3000轉/分)。仔細收集(ji)上清。保存過程(cheng)中如(ru)有沉淀形成,應(ying)再(zai)次(ci)離心(xin)。

(2)血漿:

應根據(ju)標本(ben)的要求選擇EDTA、檸檬酸(suan)鈉或(huo)肝素作為抗(kang)凝(ning)劑,混合10-20分(fen)(fen)鐘后(hou),離(li)心(xin)20分(fen)(fen)鐘左右(2000-3000轉/分(fen)(fen))。仔細(xi)收集(ji)上清。保存過程中如有(you)沉淀形成,應再(zai)次離(li)心(xin)。

(3)尿液:

用無(wu)菌管收(shou)集(ji)。離(li)心20分鐘左右(2000-3000轉/分)。仔細收(shou)集(ji)上清(qing)。保(bao)存過程中如有(you)沉淀形成,應再次離(li)心。胸腹水、腦脊(ji)液(ye)參照(zhao)此實行(xing)。

(4)細(xi)胞培養上清:

檢測分泌性的(de)成份時(shi),用(yong)無菌管收集。離心(xin)20分鐘(zhong)左右(2000-3000轉/分)。仔細收集上清。

(5)培養細胞

檢測(ce)細胞(bao)(bao)內的(de)成(cheng)份(fen)時,用PBS(PH7.2-7.4)稀(xi)釋細胞(bao)(bao)懸液,細胞(bao)(bao)濃度達到100萬(wan)/ml左右。通過反復凍融或加入組織蛋白萃取試劑(ji),以使細胞(bao)(bao)破壞并放出細胞(bao)(bao)內成(cheng)份(fen)。離(li)(li)心(xin)(xin)20分(fen)鐘左右(2000-3000轉(zhuan)/分(fen))。仔細收集(ji)上清(qing)。保存過程中(zhong)如有沉淀(dian)形成(cheng),應(ying)再(zai)次離(li)(li)心(xin)(xin)。

(6)組織標本

切割標本(ben)后,稱取(qu)重量。加入一(yi)(yi)定量的PBS,PH7.4。用(yong)液(ye)氮迅速冷(leng)凍保(bao)存(cun)備(bei)用(yong)。標本(ben)融(rong)化后仍然保(bao)持2-8℃的溫度(du)。加入一(yi)(yi)定量的PBS(PH7.4),或(huo)組織(zhi)蛋白萃(cui)取(qu)試劑, 用(yong)手工或(huo)勻漿器將標本(ben)勻漿化。離心20分鐘左右(2000-3000轉/分)。仔細(xi)收集上清。分裝后一(yi)(yi)份待檢測,其(qi)余冷(leng)凍備(bei)用(yong)。

操作步驟


1. 標(biao)(biao)準(zhun)品(pin)(pin)的稀(xi)(xi)(xi)釋(shi)與加(jia)樣:在(zai)(zai)酶(mei)標(biao)(biao)包被(bei)板上(shang)設標(biao)(biao)準(zhun)品(pin)(pin)孔(kong)(kong)10孔(kong)(kong),在(zai)(zai)di一(yi)、第(di)(di)(di)(di)(di)二孔(kong)(kong)中(zhong)分(fen)(fen)別(bie)(bie)(bie)(bie)加(jia)標(biao)(biao)準(zhun)品(pin)(pin)100μl,然后(hou)在(zai)(zai)di一(yi)、第(di)(di)(di)(di)(di)二孔(kong)(kong)中(zhong)加(jia)標(biao)(biao)準(zhun)品(pin)(pin)稀(xi)(xi)(xi)釋(shi)液(ye)50μl,混(hun)(hun)(hun)勻;然后(hou)從di一(yi)孔(kong)(kong)、第(di)(di)(di)(di)(di)二孔(kong)(kong)中(zhong)各(ge)(ge)取(qu)(qu)100μl分(fen)(fen)別(bie)(bie)(bie)(bie)加(jia)到第(di)(di)(di)(di)(di)三孔(kong)(kong)和(he)第(di)(di)(di)(di)(di)四(si)(si)孔(kong)(kong),再(zai)(zai)(zai)在(zai)(zai)第(di)(di)(di)(di)(di)三、第(di)(di)(di)(di)(di)四(si)(si)孔(kong)(kong)分(fen)(fen)別(bie)(bie)(bie)(bie)加(jia)標(biao)(biao)準(zhun)品(pin)(pin)稀(xi)(xi)(xi)釋(shi)液(ye)50μl,混(hun)(hun)(hun)勻;然后(hou)在(zai)(zai)第(di)(di)(di)(di)(di)三孔(kong)(kong)和(he)第(di)(di)(di)(di)(di)四(si)(si)孔(kong)(kong)中(zhong)先各(ge)(ge)取(qu)(qu)50μl棄(qi)掉(diao),再(zai)(zai)(zai)各(ge)(ge)取(qu)(qu)50μl分(fen)(fen)別(bie)(bie)(bie)(bie)取(qu)(qu)50μl分(fen)(fen)別(bie)(bie)(bie)(bie)加(jia)到第(di)(di)(di)(di)(di)七(qi)、第(di)(di)(di)(di)(di)八(ba)孔(kong)(kong)中(zhong),再(zai)(zai)(zai)在(zai)(zai)第(di)(di)(di)(di)(di)七(qi)、第(di)(di)(di)(di)(di)八(ba)孔(kong)(kong)中(zhong)分(fen)(fen)別(bie)(bie)(bie)(bie)加(jia)標(biao)(biao)準(zhun)品(pin)(pin)稀(xi)(xi)(xi)釋(shi)液(ye)50μl,混(hun)(hun)(hun)勻后(hou)從第(di)(di)(di)(di)(di)七(qi)、第(di)(di)(di)(di)(di)八(ba)孔(kong)(kong)中(zhong)加(jia)到第(di)(di)(di)(di)(di)五(wu)、第(di)(di)(di)(di)(di)六(liu)(liu)孔(kong)(kong)中(zhong),再(zai)(zai)(zai)在(zai)(zai)第(di)(di)(di)(di)(di)五(wu)、第(di)(di)(di)(di)(di)六(liu)(liu)孔(kong)(kong)中(zhong)分(fen)(fen)別(bie)(bie)(bie)(bie)加(jia)標(biao)(biao)準(zhun)品(pin)(pin)稀(xi)(xi)(xi)釋(shi)液(ye)50ul,混(hun)(hun)(hun)勻;混(hun)(hun)(hun)勻后(hou)從第(di)(di)(di)(di)(di)五(wu)、第(di)(di)(di)(di)(di)六(liu)(liu)孔(kong)(kong)中(zhong)各(ge)(ge)分(fen)(fen)別(bie)(bie)(bie)(bie)取(qu)(qu)50μl加(jia)到第(di)(di)(di)(di)(di)九(jiu)、第(di)(di)(di)(di)(di)十(shi)孔(kong)(kong)中(zhong),再(zai)(zai)(zai)在(zai)(zai)第(di)(di)(di)(di)(di)九(jiu)第(di)(di)(di)(di)(di)十(shi)孔(kong)(kong)分(fen)(fen)別(bie)(bie)(bie)(bie)加(jia)標(biao)(biao)準(zhun)品(pin)(pin)稀(xi)(xi)(xi)釋(shi)液(ye)50μl,混(hun)(hun)(hun)勻后(hou)從第(di)(di)(di)(di)(di)九(jiu)第(di)(di)(di)(di)(di)十(shi)孔(kong)(kong)中(zhong)各(ge)(ge)取(qu)(qu)50μl棄(qi)掉(diao)。(稀(xi)(xi)(xi)釋(shi)后(hou)各(ge)(ge)孔(kong)(kong)加(jia)樣量都為50μl,濃度分(fen)(fen)別(bie)(bie)(bie)(bie)為180 ng/L,120 ng/L ,60 ng/L,30 ng/,15 ng/L)。

2. 加樣(yang):分別設空(kong)白(bai)孔(kong)(kong)(空(kong)白(bai)對(dui)照孔(kong)(kong)不加樣(yang)品(pin)及酶(mei)(mei)標(biao)試(shi)劑,其(qi)余各步(bu)操作(zuo)相(xiang)同)、待測(ce)樣(yang)品(pin)孔(kong)(kong)。在酶(mei)(mei)標(biao)包被板上待測(ce)樣(yang)品(pin)孔(kong)(kong)中先加樣(yang)品(pin)稀(xi)(xi)釋(shi)液40μl,然后再(zai)加待測(ce)樣(yang)品(pin)10μl(樣(yang)品(pin)最終稀(xi)(xi)釋(shi)度為5倍)。加樣(yang)將(jiang)樣(yang)品(pin)加于酶(mei)(mei)標(biao)板孔(kong)(kong)底(di)部(bu),盡量(liang)不觸(chu)及孔(kong)(kong)壁,輕(qing)輕(qing)晃(huang)動混勻。

3. 溫(wen)育:用封板膜(mo)封板后置37℃溫(wen)育30分鐘。

4. 配液(ye):將30(48T的20倍(bei)(bei)(bei))倍(bei)(bei)(bei)濃(nong)縮洗滌液(ye)用(yong)蒸餾水30(48T的20倍(bei)(bei)(bei))倍(bei)(bei)(bei)稀釋后備用(yong)。

5. 洗(xi)滌:小心揭掉封板膜,棄去液體,甩(shuai)干,每孔加滿(man)洗(xi)滌液,靜置30秒后棄去,如此重復(fu)5次,拍干。

6. 加酶:每孔加入酶標(biao)試劑50μl,空白孔除外。

7. 溫育:操作(zuo)同3。

8. 洗滌:操作同5。

9. 顯(xian)色(se):每(mei)孔先(xian)加入(ru)顯(xian)色(se)劑A50μl,再加入(ru)顯(xian)色(se)劑B50μl,輕輕震蕩混勻(yun),37℃避(bi)光顯(xian)色(se)15分鐘(zhong).

10. 終(zhong)止:每(mei)孔加(jia)終(zhong)止液50μl,終(zhong)止反(fan)應(此時(shi)藍色(se)立轉黃色(se))。

11. 測(ce)(ce)定(ding):以空白空調零,450nm波長依序測(ce)(ce)量各孔的吸光(guang)度(OD值)。 測(ce)(ce)定(ding)應在(zai)加(jia)終(zhong)止液后15分(fen)鐘(zhong)。

注意(yi)事項


1. 試劑盒從冷(leng)藏環境中(zhong)取出應在室(shi)溫(wen)平衡(heng)15-30 分鐘后(hou)方(fang)可使用,酶標(biao)包被板開封后(hou)如未用完,板條應裝入密(mi)封袋中(zhong)保存。


2. 濃洗滌(di)液(ye)可(ke)能(neng)會有結晶(jing)析出,稀(xi)釋時可(ke)在水浴中(zhong)加溫助溶,洗滌(di)時不影響結果。


3. 各步加(jia)樣均應使用加(jia)樣器,并經(jing)常校對其準確(que)性,以避免試(shi)驗誤(wu)差。一次加(jia)樣時間(jian)好控(kong)制在(zai)5 分鐘內,如標本數量多(duo),推薦(jian)使用排槍加(jia)樣。


4. 封板膜只限一次性使用(yong),以避免交叉污染。


5. 底物請避(bi)光(guang)保(bao)存。


6. 嚴格按照(zhao)說明書的操作進行,試驗結果判定必須以(yi)酶標儀讀數為(wei)準(zhun).


7. 所有樣品,洗滌(di)液和各種廢(fei)棄(qi)物都應按(an)傳染(ran)物處理。


8. 本(ben)試(shi)劑(ji)不(bu)同批(pi)號組(zu)分不(bu)得(de)混用。


9.如(ru)需代(dai)測或者樣本暫時不測定(ding),可(ke)立即低(di)溫(wen)凍存(cun)(cun),溫(wen)度越低(di)越好(hao),中(zhong)間(jian)避免(mian)反復凍融,-20℃以(yi)(yi)下(xia)可(ke)保(bao)存(cun)(cun)三(san)個(ge)(ge)月,-70℃以(yi)(yi)下(xia)可(ke)保(bao)存(cun)(cun)六個(ge)(ge)月。

10.試劑使用(yong)須(xu)知:

11.(1)請參(can)照相關法(fa)規、文獻、MSDS等信息,理解并掌(zhang)握好試劑(ji)的特(te)性,再進行(xing)安全操作。

12.(2)通常購買(mai)試劑(ji)時一定要想(xiang)到一次性用完。若(ruo)估算不足有剩余的話(hua),更(geng)加(jia)注意其他(ta)保管(guan)和管(guan)理。

13.(3)萬一試劑操(cao)作者并非專業(ye)技術人員。必須在專業(ye)人士的(de)指導監督下進行操(cao)作。對于使用后的(de)廢棄物,不要(yao)或者舊(jiu)的(de)試劑,應按照相關法律法規(gui)正當處理。

14.(4)購買后,請務(wu)必確認標簽上的(de)注(zhu)意(yi)事項;做(zuo)好預防顛(dian)倒,摔壞的(de)措施(shi)和管(guan)理體制;在(zai)使用前再次確認標簽上的(de)注(zhu)意(yi)事項,做(zuo)好必要(yao)的(de)安全對策;對沒有標明(ming)其危害特(te)性、有害特(te)性的(de),也要(yao)慎重(zhong)地進行操(cao)(cao)作(zuo)(zuo);必須帶(dai)好防護(hu)用具(ju),小心翼翼進行操(cao)(cao)作(zuo)(zuo)。


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