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新聞詳(xiang)情(qing)

煙曲霉探針法熒光定量PCR試劑盒說明書

發表時間:2024-03-22 16:13

                                                 煙曲霉探針法熒光定量PCR試劑盒說明書

產品特點

1. 使用(yong)化(hua)學修飾(shi)的熱啟(qi)動聚合酶(mei),反應特(te)(te)異性(xing)高,*程度地避(bi)免了非特(te)(te)異擴增;

2. 反(fan)應緩(huan)沖液經充分(fen)(fen)優化,反(fan)應靈(ling)敏(min)快速,40個循環只需(xu)20多分(fen)(fen)鐘;

3. 抗干(gan)擾(rao)能力強,反應(ying)重(zhong)復性高,適合對土(tu)壤(rang)、糞便、腫瘤和血液來源的復雜樣本(ben)中(zhong)的靶(ba)基因進行檢測分析。

在PCR反(fan)應體系中加入熒光基團,利用(yong)熒光信號積(ji)累實時(shi)監測整個PCR進程,zui后通過標準曲線對未知模(mo)板進行(xing)定量分析的方法。

特異性熒(ying)光標(biao)記:

TaqMan法

TaqMan探針(zhen)的特性(xing):

(1)5′端標(biao)記有報告基(ji)團(Reporter, R),如FAM、VIC等

(2)3′端標(biao)記有熒光(guang)淬滅基團 (Quencher, Q)

(3)探針(zhen)完(wan)整,R所發射的熒(ying)光能(neng)量被Q基團吸(xi)收 ,無熒(ying)光, R與Q分開,發熒(ying)光

(4)Taq酶(mei)有 5′→3′外切核酸酶(mei)活性(xing),可水解探(tan)針

相對定量通過內標定量:

內標(Endogenous Control)通(tong)常是(shi)β-actin、GAPDH基因等看家基因,在細(xi)(xi)胞中的表(biao)達量(liang)或在基因組中的拷貝(bei)數(shu)恒定,受(shou)環境因素影響(xiang)小,內標定量(liang)結果代表(biao)了樣本(ben)中所含(han)細(xi)(xi)胞或基因組數(shu)量(liang)。

相對(dui)定量(liang)分(fen)析方法   :

2-ΔΔCt

前提:目標序列(lie)和內參(can)序列(lie)的(de)擴增效率接近100%且(qie)偏差在5%以內

  1、用(yong)內參基因的(de)CT值歸一目標基因的(de)CT值:

    ΔCT(test)= CT(target,test)-CT(ref,test)

    ΔCT(calibrator)= CT(target,calibrator)-CT(ref, calibrator)

  2、用校準樣(yang)本的(de)ΔCT值歸一試驗樣(yang)本的(de)ΔCT值:

         ΔΔCT= ΔCT(test) - ΔCT(calibrator)

  3、計算表(biao)達水平比率:

                    2 –ΔΔCT=表達量的比(bi)值(zhi)

熒光定量PCR檢測方法包括以(yi)下步驟:

(1)將參照(zhao)(zhao)基因(yin)與待測目(mu)的(de)(de)基因(yin)片段等比例連接,克隆到(dao)同(tong)(tong)一(yi)個質(zhi)粒載(zai)體上,構建一(yi)種(zhong)可同(tong)(tong)時用(yong)于參照(zhao)(zhao)基因(yin)以(yi)及待測目(mu)的(de)(de)基因(yin)擴增(zeng)檢測的(de)(de)標準品,并將所得標準品按照(zhao)(zhao)濃度梯度稀釋后同(tong)(tong)時用(yong)于繪制(zhi)參照(zhao)(zhao)基因(yin)以(yi)及待測目(mu)的(de)(de)基因(yin)的(de)(de)標準曲(qu)線;

(2)待(dai)測(ce)樣本與步驟(1)所述標準品經(jing)同步進行實時(shi)熒光定(ding)量PCR擴增后,目(mu)的(de)基(ji)因(yin)與參照(zhao)(zhao)基(ji)因(yin)按(an)照(zhao)(zhao)各自的(de)標準曲線計算各自的(de)拷貝(bei)(bei)數(shu),計算待(dai)測(ce)樣本的(de)目(mu)的(de)基(ji)因(yin)與參照(zhao)(zhao)基(ji)因(yin)拷貝(bei)(bei)數(shu)比(bi)值,即(ji)得目(mu)的(de)基(ji)因(yin)的(de)拷貝(bei)(bei)數(shu)相對定(ding)量檢(jian)測(ce)結果。

其中步驟(1)為:將(jiang)參照基因(yin)與待測(ce)目(mu)的(de)(de)(de)基因(yin)片(pian)段等比例連(lian)接,克(ke)隆到同(tong)一(yi)個質粒(li)載體上,構建一(yi)種可(ke)同(tong)時用于參照基因(yin)以及待測(ce)目(mu)的(de)(de)(de)基因(yin)擴增檢測(ce)的(de)(de)(de)標準(zhun)(zhun)品,并將(jiang)所得標準(zhun)(zhun)品按照濃度(du)梯度(du)稀釋后同(tong)時用于繪制參照基因(yin)以及待測(ce)目(mu)的(de)(de)(de)基因(yin)的(de)(de)(de)標準(zhun)(zhun)曲線。

其(qi)中(zhong)所(suo)述(shu)參(can)(can)(can)照(zhao)(zhao)基(ji)(ji)因(yin)(yin)為(wei)(wei)本領域(yu)(yu)常(chang)規(gui)(gui)參(can)(can)(can)照(zhao)(zhao)基(ji)(ji)因(yin)(yin),較(jiao)佳地(di)管家(jia)基(ji)(ji)因(yin)(yin),優(you)選(xuan)地(di)為(wei)(wei)RPPH1的(de)(de)(de)擴(kuo)增(zeng)區(qu)域(yu)(yu),其(qi)中(zhong)所(suo)述(shu)質(zhi)粒載(zai)體為(wei)(wei)本領域(yu)(yu)常(chang)規(gui)(gui)質(zhi)粒載(zai)體,較(jiao)佳地(di)為(wei)(wei)PCR克(ke)隆載(zai)體,優(you)選(xuan)地(di)為(wei)(wei)TA cloning載(zai)體,所(suo)述(shu)TA cloning載(zai)體較(jiao)佳地(di)為(wei)(wei)pMD18-T載(zai)體。其(qi)中(zhong)所(suo)述(shu)標(biao)準(zhun)品(pin)的(de)(de)(de)核(he)酸序(xu)(xu)列如序(xu)(xu)列表中(zhong)SEQ ID NO:6所(suo)示(shi)。所(suo)述(shu)的(de)(de)(de)等比(bi)例較(jiao)佳地(di)為(wei)(wei)1:1。由于(yu)標(biao)準(zhun)品(pin)中(zhong)待測目(mu)的(de)(de)(de)基(ji)(ji)因(yin)(yin)與參(can)(can)(can)照(zhao)(zhao)基(ji)(ji)因(yin)(yin)的(de)(de)(de)比(bi)例為(wei)(wei)1:1,解決了目(mu)前相對(dui)標(biao)準(zhun)曲線法應用中(zhong)目(mu)的(de)(de)(de)基(ji)(ji)因(yin)(yin)與參(can)(can)(can)照(zhao)(zhao)基(ji)(ji)因(yin)(yin)的(de)(de)(de)濃度比(bi)例關系難以控制的(de)(de)(de)問(wen)題(ti),提(ti)高HER2基(ji)(ji)因(yin)(yin)擴(kuo)增(zeng)檢測的(de)(de)(de)可靠性。

步驟(zou)(2)為(wei):待(dai)測(ce)(ce)(ce)樣本(ben)與(yu)步驟(zou)(1)所(suo)述標準(zhun)品(pin)經(jing)同步進行實時熒光定(ding)(ding)量(liang)PCR擴增后,目(mu)(mu)的(de)(de)基(ji)(ji)因(yin)(yin)與(yu)參照(zhao)基(ji)(ji)因(yin)(yin)按照(zhao)各自(zi)的(de)(de)標準(zhun)曲(qu)線計(ji)算各自(zi)的(de)(de)拷貝數,計(ji)算待(dai)測(ce)(ce)(ce)樣本(ben)的(de)(de)目(mu)(mu)的(de)(de)基(ji)(ji)因(yin)(yin)與(yu)參照(zhao)基(ji)(ji)因(yin)(yin)拷貝數比值,即得目(mu)(mu)的(de)(de)基(ji)(ji)因(yin)(yin)的(de)(de)拷貝數相對(dui)定(ding)(ding)量(liang)檢測(ce)(ce)(ce)結果。

其中所(suo)述待測目(mu)的基(ji)因為本領域(yu)常規(gui)待測目(mu)的基(ji)因,較(jiao)佳(jia)(jia)地為腫(zhong)瘤或者疾病的特異性基(ji)因,更佳(jia)(jia)地為HER2基(ji)因的擴增(zeng)區(qu)域(yu),所(suo)述熒(ying)光(guang)(guang)定(ding)(ding)(ding)量PCR擴增(zeng)為本領域(yu)常規(gui)熒(ying)光(guang)(guang)定(ding)(ding)(ding)量PCR擴增(zeng)方法,所(suo)述熒(ying)光(guang)(guang)定(ding)(ding)(ding)量PCR擴增(zeng)方法較(jiao)佳(jia)(jia)地為多通道熒(ying)光(guang)(guang)定(ding)(ding)(ding)量PCR擴增(zeng),更佳(jia)(jia)地為雙通道熒(ying)光(guang)(guang)定(ding)(ding)(ding)量PCR擴增(zeng)。 正辛酸(suan)乙酯(zhi)shēng huà shì jì容量:100毫(hao)克   大鼠環加氧酶(mei)2(COX-2)免疫試劑盒 Rat cyclooxygenase-2,COX-2 ELISA Kit

實驗(yan)注意(yi)事(shi)項:


1)RT-PCR可以檢(jian)測(ce)組織、細胞、血液(ye)、細菌(jun)等很多材料(liao),不同的(de)樣本(ben)有(you)不同要求(qiu),實(shi)驗(yan)前請充分(fen)溝通確認實(shi)驗(yan)方案和樣本(ben)情(qing)況;


2)客戶盡可(ke)能提供實(shi)驗的(de)背景信(xin)息、物種、基因準確的(de)名(ming)稱和ID號;


3)客(ke)戶盡量不(bu)要提供(gong)DNA或RNA樣(yang)品。


4)樣(yang)本(ben)保(bao)存于液氮(dan)或(huo)干冰,也可以保(bao)存于Trizol液中。


實時熒(ying)光定量(liang)(liang)(liang)PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)是(shi)指(zhi)(zhi)在PCR反應(ying)體系中加(jia)入熒(ying)光基團,利(li)用(yong)(yong)熒(ying)光信號積累實時監測(ce)整(zheng)個PCR進程,*通過(guo)標準(zhun)曲線對未知模(mo)板進行定量(liang)(liang)(liang)分(fen)析的方(fang)法。實時熒(ying)光定量(liang)(liang)(liang)PCR的化學原理包括(kuo)探(tan)(tan)(tan)針(zhen)(zhen)類(lei)和非探(tan)(tan)(tan)針(zhen)(zhen)類(lei)兩類(lei),探(tan)(tan)(tan)針(zhen)(zhen)類(lei)是(shi)利(li)用(yong)(yong)與靶細胞序列特異(yi)性雜交的探(tan)(tan)(tan)針(zhen)(zhen)來(lai)指(zhi)(zhi)示擴(kuo)增(zeng)產物(wu)的增(zeng)加(jia),非探(tan)(tan)(tan)針(zhen)(zhen)類(lei)是(shi)利(li)用(yong)(yong)熒(ying)光染料(liao)或者特異(yi)性設計的引物(wu)來(lai)指(zhi)(zhi)示擴(kuo)增(zeng)的增(zeng)加(jia)。運用(yong)(yong)該技術可以(yi)對DNA、RNA樣品(pin)進行定量(liang)(liang)(liang)(包括(kuo)*定量(liang)(liang)(liang)和相對定量(liang)(liang)(liang))和定性分(fen)析。


主要服務:DNA或RNA的*定(ding)量分析、基因表(biao)達差異分析、基因分型。


主要技術:引物設計、RNA提取、cDNA合成、qPCR。


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