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豬巨噬細胞炎性蛋白1βelisa檢測試劑盒說明書

發表時間:2024-04-19 16:58

                                            豬巨噬細胞炎性蛋白1βelisa檢測試劑盒說明書

 

elisa試劑盒常見組(zu)成部分(fen):

1)酶和(he)底(di)物:在(zai)ELISA中zui常用(yong)的酶為HRP和(he)ALP。

2)抗(kang)體(ti)(ti):在ELISA中應用的抗(kang)體(ti)(ti)可分為多克(ke)隆(long)抗(kang)體(ti)(ti)(多抗(kang))和單(dan)克(ke)隆(long)抗(kang)體(ti)(ti)(單(dan)抗(kang))。

3)抗原(yuan)(yuan):在ELISA中應用的(de)抗原(yuan)(yuan)要求有(you)較高的(de)特異性、親和力和純度。主要有(you)三(san)類,即自然(ran)抗原(yuan)(yuan)、人工合成抗原(yuan)(yuan)和基因重(zhong)組抗原(yuan)(yuan)。

4 人E選擇素(su)(E-Selectin/CD62E)檢測試劑(ji)盒包被:將免疫活性物質(抗(kang)原或抗(kang)體)結合于固(gu)相(xiang)載體上的過程稱(cheng)為包被。常用的材料(liao)有(you)聚(ju)苯乙烯(xi)、硝酸(suan)纖維薄膜等;常用的方法(fa)有(you)吸附法(fa)、化(hua)學交(jiao)聯法(fa)及親和素(su)-生物素(su)間接包被法(fa)

5)固(gu)相載(zai)體:固(gu)相載(zai)體是ELISA中用以分離結(jie)(jie)合(he)標(biao)記(ji)物和(he)(he)游(you)離標(biao)記(ji)物的主要手段,應與(yu)各(ge)種免疫(yi)活性(xing)物質(zhi)有良好的結(jie)(jie)合(he)性(xing)能并且不(bu)改變其免疫(yi)活性(xing)。常用的固(gu)相載(zai)體有聚苯乙(yi)烯塑料(liao)和(he)(he)硝酸纖(xian)維素(su)膜。

樣本實驗前準(zhun)備:

ELISA試劑盒液體(ti)樣本:包括血清、血漿、尿液、胸(xiong)腹(fu)水、腦脊液、細胞培養上清等(deng)。

(1)血(xue)清(qing)

室溫血液自然凝固10-20分鐘后,離心(xin)20分鐘左右(you)(2000-3000轉/分)。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形(xing)成(cheng),應再次(ci)離心(xin)。

(2)血漿(jiang):

應根據標(biao)本的要(yao)求選擇(ze)EDTA、檸檬酸鈉或肝素作(zuo)為抗凝劑,混合10-20分鐘(zhong)后,離(li)心20分鐘(zhong)左右(2000-3000轉/分)。仔細收集上清(qing)。保存過(guo)程中(zhong)如(ru)有沉淀形成,應再(zai)次(ci)離(li)心。

(3)尿液:

用無菌管收(shou)集。離(li)心20分鐘左右(2000-3000轉/分)。仔細(xi)收(shou)集上清。保存過程中如(ru)有沉淀形成,應再次離(li)心。胸(xiong)腹(fu)水、腦(nao)脊液參照(zhao)此實行。

(4)細胞(bao)培養上清:

檢測分泌性的成份時(shi),用(yong)無菌(jun)管收(shou)集。離心20分鐘左右(you)(2000-3000轉/分)。仔細(xi)收(shou)集上清。

(5)培養細胞

檢測細(xi)胞(bao)內的成份(fen)時(shi),用PBS(PH7.2-7.4)稀釋細(xi)胞(bao)懸(xuan)液(ye),細(xi)胞(bao)濃度(du)達到100萬(wan)/ml左右。通(tong)過反復(fu)凍(dong)融或加(jia)入組(zu)織蛋白(bai)萃取(qu)試劑,以使細(xi)胞(bao)破(po)壞(huai)并放(fang)出細(xi)胞(bao)內成份(fen)。離(li)心20分鐘(zhong)左右(2000-3000轉(zhuan)/分)。仔細(xi)收集上(shang)清。保存過程中如有沉淀形成,應再次離(li)心。

(6)組織(zhi)標本

切割(ge)標本后,稱取(qu)重量。加入一定(ding)量的(de)PBS,PH7.4。用(yong)液氮迅速冷凍保(bao)存(cun)備用(yong)。標本融(rong)化后仍(reng)然保(bao)持2-8℃的(de)溫度(du)。加入一定(ding)量的(de)PBS(PH7.4),或(huo)組織蛋白(bai)萃取(qu)試劑(ji), 用(yong)手工(gong)或(huo)勻漿器將標本勻漿化。離心20分鐘左右(2000-3000轉/分)。仔細收集上清。分裝后一份待檢測,其(qi)余冷凍備用(yong)。

操(cao)作步驟(zou)


1. 標(biao)(biao)(biao)(biao)準(zhun)品的稀(xi)(xi)(xi)釋(shi)(shi)(shi)與加(jia)(jia)(jia)(jia)樣(yang):在酶標(biao)(biao)(biao)(biao)包被板上(shang)設標(biao)(biao)(biao)(biao)準(zhun)品孔(kong)(kong)(kong)(kong)(kong)10孔(kong)(kong)(kong)(kong)(kong),在di一(yi)(yi)、第(di)二(er)孔(kong)(kong)(kong)(kong)(kong)中(zhong)分(fen)別加(jia)(jia)(jia)(jia)標(biao)(biao)(biao)(biao)準(zhun)品100μl,然(ran)后(hou)在di一(yi)(yi)、第(di)二(er)孔(kong)(kong)(kong)(kong)(kong)中(zhong)加(jia)(jia)(jia)(jia)標(biao)(biao)(biao)(biao)準(zhun)品稀(xi)(xi)(xi)釋(shi)(shi)(shi)液(ye)(ye)(ye)50μl,混勻(yun)(yun);然(ran)后(hou)從di一(yi)(yi)孔(kong)(kong)(kong)(kong)(kong)、第(di)二(er)孔(kong)(kong)(kong)(kong)(kong)中(zhong)各(ge)(ge)取(qu)(qu)100μl分(fen)別加(jia)(jia)(jia)(jia)到(dao)第(di)三孔(kong)(kong)(kong)(kong)(kong)和第(di)四(si)孔(kong)(kong)(kong)(kong)(kong),再(zai)在第(di)三、第(di)四(si)孔(kong)(kong)(kong)(kong)(kong)分(fen)別加(jia)(jia)(jia)(jia)標(biao)(biao)(biao)(biao)準(zhun)品稀(xi)(xi)(xi)釋(shi)(shi)(shi)液(ye)(ye)(ye)50μl,混勻(yun)(yun);然(ran)后(hou)在第(di)三孔(kong)(kong)(kong)(kong)(kong)和第(di)四(si)孔(kong)(kong)(kong)(kong)(kong)中(zhong)先各(ge)(ge)取(qu)(qu)50μl棄掉,再(zai)各(ge)(ge)取(qu)(qu)50μl分(fen)別取(qu)(qu)50μl分(fen)別加(jia)(jia)(jia)(jia)到(dao)第(di)七、第(di)八(ba)孔(kong)(kong)(kong)(kong)(kong)中(zhong),再(zai)在第(di)七、第(di)八(ba)孔(kong)(kong)(kong)(kong)(kong)中(zhong)分(fen)別加(jia)(jia)(jia)(jia)標(biao)(biao)(biao)(biao)準(zhun)品稀(xi)(xi)(xi)釋(shi)(shi)(shi)液(ye)(ye)(ye)50μl,混勻(yun)(yun)后(hou)從第(di)七、第(di)八(ba)孔(kong)(kong)(kong)(kong)(kong)中(zhong)加(jia)(jia)(jia)(jia)到(dao)第(di)五、第(di)六孔(kong)(kong)(kong)(kong)(kong)中(zhong),再(zai)在第(di)五、第(di)六孔(kong)(kong)(kong)(kong)(kong)中(zhong)分(fen)別加(jia)(jia)(jia)(jia)標(biao)(biao)(biao)(biao)準(zhun)品稀(xi)(xi)(xi)釋(shi)(shi)(shi)液(ye)(ye)(ye)50ul,混勻(yun)(yun);混勻(yun)(yun)后(hou)從第(di)五、第(di)六孔(kong)(kong)(kong)(kong)(kong)中(zhong)各(ge)(ge)分(fen)別取(qu)(qu)50μl加(jia)(jia)(jia)(jia)到(dao)第(di)九(jiu)、第(di)十孔(kong)(kong)(kong)(kong)(kong)中(zhong),再(zai)在第(di)九(jiu)第(di)十孔(kong)(kong)(kong)(kong)(kong)分(fen)別加(jia)(jia)(jia)(jia)標(biao)(biao)(biao)(biao)準(zhun)品稀(xi)(xi)(xi)釋(shi)(shi)(shi)液(ye)(ye)(ye)50μl,混勻(yun)(yun)后(hou)從第(di)九(jiu)第(di)十孔(kong)(kong)(kong)(kong)(kong)中(zhong)各(ge)(ge)取(qu)(qu)50μl棄掉。(稀(xi)(xi)(xi)釋(shi)(shi)(shi)后(hou)各(ge)(ge)孔(kong)(kong)(kong)(kong)(kong)加(jia)(jia)(jia)(jia)樣(yang)量都為(wei)50μl,濃度分(fen)別為(wei)180 ng/L,120 ng/L ,60 ng/L,30 ng/,15 ng/L)。

2. 加(jia)(jia)樣(yang)(yang):分別設空白孔(kong)(空白對照孔(kong)不加(jia)(jia)樣(yang)(yang)品(pin)及酶(mei)(mei)標(biao)試(shi)劑,其余各(ge)步操作相同)、待測(ce)樣(yang)(yang)品(pin)孔(kong)。在酶(mei)(mei)標(biao)包被板(ban)上待測(ce)樣(yang)(yang)品(pin)孔(kong)中先加(jia)(jia)樣(yang)(yang)品(pin)稀(xi)釋液40μl,然后再加(jia)(jia)待測(ce)樣(yang)(yang)品(pin)10μl(樣(yang)(yang)品(pin)最終稀(xi)釋度為(wei)5倍(bei))。加(jia)(jia)樣(yang)(yang)將樣(yang)(yang)品(pin)加(jia)(jia)于酶(mei)(mei)標(biao)板(ban)孔(kong)底部,盡量不觸及孔(kong)壁,輕輕晃動(dong)混勻。

3. 溫(wen)育:用封(feng)板(ban)膜封(feng)板(ban)后置37℃溫(wen)育30分鐘。

4. 配液:將30(48T的20倍(bei)(bei))倍(bei)(bei)濃縮洗滌(di)液用蒸餾水30(48T的20倍(bei)(bei))倍(bei)(bei)稀釋后備用。

5. 洗(xi)滌(di):小(xiao)心(xin)揭掉封板膜,棄去液(ye)體,甩干,每孔(kong)加滿洗(xi)滌(di)液(ye),靜置(zhi)30秒后棄去,如此重(zhong)復5次,拍干。

6. 加酶(mei):每孔加入酶(mei)標(biao)試劑50μl,空(kong)白孔除外。

7. 溫育:操作(zuo)同3。

8. 洗滌:操作同5。

9. 顯(xian)色:每孔先加入顯(xian)色劑A50μl,再加入顯(xian)色劑B50μl,輕輕震蕩混勻,37℃避光(guang)顯(xian)色15分鐘.

10. 終止:每孔加(jia)終止液50μl,終止反應(ying)(此時藍色立(li)轉(zhuan)黃(huang)色)。

11. 測定:以空(kong)白空(kong)調零,450nm波長依(yi)序測量各孔的吸光(guang)度(OD值)。 測定應在加終(zhong)止液后15分(fen)鐘。

注意(yi)事項


1. 試劑盒(he)從冷(leng)藏環境中(zhong)取出(chu)應(ying)(ying)在(zai)室(shi)溫平衡15-30 分鐘后方可使用,酶標包被板(ban)開(kai)封后如未用完,板(ban)條應(ying)(ying)裝入密封袋中(zhong)保存(cun)。


2. 濃洗(xi)滌液可能會有結(jie)晶析(xi)出,稀釋時(shi)可在水(shui)浴中加溫(wen)助溶,洗(xi)滌時(shi)不影響結(jie)果。


3. 各步加(jia)(jia)樣(yang)均應使用(yong)(yong)加(jia)(jia)樣(yang)器,并經常校(xiao)對其準確性,以避免(mian)試驗誤(wu)差(cha)。一次(ci)加(jia)(jia)樣(yang)時間(jian)好控制(zhi)在5 分鐘內,如標本數量(liang)多,推薦使用(yong)(yong)排(pai)槍(qiang)加(jia)(jia)樣(yang)。


4. 封板膜只限(xian)一次性使用(yong),以避免交叉(cha)污染(ran)。


5. 底物請避光保存。


6. 嚴格按照說明書的操作進行,試驗結果判定必須以酶標儀(yi)讀數為(wei)準.


7. 所有樣品,洗滌液(ye)和各種廢棄物(wu)都應(ying)按傳染物(wu)處理。


8. 本(ben)試劑(ji)不同批號組分(fen)不得混用。


9.如需代測或者樣本暫時(shi)不測定,可立即(ji)低溫(wen)凍存(cun),溫(wen)度越低越好,中間(jian)避免反(fan)復凍融,-20℃以下可保存(cun)三個月(yue),-70℃以下可保存(cun)六(liu)個月(yue)。

10.試(shi)劑使(shi)用(yong)須知:

11.(1)請(qing)參照(zhao)相關(guan)法(fa)規、文獻、MSDS等信(xin)息,理解并掌握好試劑的特性(xing),再進行安全操作。

12.(2)通常購買試劑時(shi)一定要想到(dao)一次性用完。若估算不足有剩余的話(hua),更加注意其他(ta)保(bao)管(guan)和管(guan)理。

13.(3)萬一試劑操(cao)作(zuo)者并非專業技(ji)術人員。必須在專業人士的(de)指導監督下進(jin)行(xing)操(cao)作(zuo)。對于使用后(hou)的(de)廢(fei)棄物(wu),不要(yao)或者舊的(de)試劑,應按照相(xiang)關法律(lv)法規正當處(chu)理。

14.(4)購買后(hou),請務必(bi)確認(ren)(ren)標(biao)簽上(shang)的(de)注(zhu)意事(shi)項;做好(hao)預(yu)防顛倒,摔壞的(de)措施(shi)和管理體(ti)制;在(zai)使用(yong)前再次(ci)確認(ren)(ren)標(biao)簽上(shang)的(de)注(zhu)意事(shi)項,做好(hao)必(bi)要的(de)安全對(dui)策(ce);對(dui)沒有標(biao)明其危害特(te)性、有害特(te)性的(de),也(ye)要慎重地進(jin)行(xing)(xing)操(cao)作(zuo);必(bi)須帶(dai)好(hao)防護用(yong)具(ju),小心翼翼進(jin)行(xing)(xing)操(cao)作(zuo)。


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